О группе.

Руководит научной группой доцент Сергиев Петр Владимирович .

В ее составе.

Аспиранты:

О. Авдеева

Д. Лесняк

Д. Бураковский

С.Кипарисов

Студенты

К. Шашкеев

М. Стеблянко

Рибосомология для начинающих.

    Клетка и весь организм функционируют за счет разделения труда между несколькими о сновными типами молекул: ДНК, РНК и белками. Наследственная информация о том, как должен работать организм, хранится в ДНК, которая копируется в процессе репликации. Так осуществляется сохранение и умножение этой информации. Как же эта информация считывается при построении организма? Сначала она переписывается в РНК, называемую матричной (мРНК). Затем, информация, закодированная в мРНК, используется для синтеза белка. Этот процесс называется трансляцией и изучается в нашей лаборатории.
    Участок, кодирующий белок, занимает не всю мРНК. Он начинается с инициаторного AUG кодона, которому предшествует короткая последовательность, комплементарная рибосомной РНК. Сама область, кодирующая белок состоит из последовательных кодонов из трех нуклеотидов, каждый из которых соответствует определенной аминокислоте. Некоторые аминокислоты закодированы несколькими кодонами, а три особенных стоп-кодона обозначают конец области, кодирующей белок. Каждый кодон узнается короткой РНК, называемой транспортной (тРНК). Она имеет трехнуклеотидный участок (антикодон), комплементарный кодону, а к ее концу присоединена соответствующая аминокислота.
    Взаимодействие мРНК и тРНК происходит при помощи молекулярной машины, называемой рибосомой. Она состоит из 2 субчастиц: большой (50S) и малой (30S). В состав малой входит 16S РНК, не кодирующая никаких белков, но играющая ключевую роль в построении и функционировании рибосомы. Кроме 16S РНК в состав малой субчастицы входит 21 различный белок (от S1 до S21). Основная функция малой субчастицы - считывание мРНК (декодирование), т.е. обеспечение правильности взаимодействия кодонов мРНК с антикодонами тРНК. Функция большой субъединицы - запись информации - т.е. синтез белка. Сам синтез состоит в последовательном наращивании белковой цепи на одну аминокислоту, приносимую тРНК. Большая субъединица построена из 2х РНК- 23S и 5S и 31 белка (от L1 до L34).
    В рибосоме имеется 3 участка связывания тРНК:A, P и E. К тРНК Р-участка присоединен уже синтезированыый пептид. В А-участке находится тРНК с новой аминокислотой, а в Е-участке - пустая тРНК, которая готовится покинуть рибосому. Соответственно, рост белковой цепи происходит с помощью ее переноса с тРНК в Р-участке на аминокислоту в А-участке. После этой реакции, называемой пептидилтрансферазной, пептид, удлиненный на одну аминокислоту, оказывается связанным с тРНК, находящейся в А-участке. Для продолжения синтеза белка надо переместить тРНК между участками: пептидил-тРНК должна перейти из А-участка в Р, а деацилированная, пустая тРНК, из Р-участка в Е. Кроме того, необходимо переместить мРНК на три нуклеотида (один кодон).
    Связывание аминоацил-тРНК с А-участком происходит с помощью дополнительного белка - EF-Tu, который гидролизует молекулу GTP после связывания аминоацил-тРНК с рибосомой. Перемещение тРНК между участками (транслокация) также сопровождается гидролизом GTP и осуществляется белком EF-G. Связывание этих двух белков происходит в одном и том же месте рибосомы, называемом местом связывания элонгационных факторов.
    Деятельность трех функциональных центров рибосомы-декодирующего, пептидилтрансферазного и центра связывания элонгационных факторов строго скоординирована. Оказывается, эти центры "знают" о том, что происходит в других центрах, расположенных достаточно далеко.
    В нашей лаборатории мы используем набор биохимических методов для того чтобы понять, как работает рибосома и, в первую очередь, как функциональные центры "общаются" друг с другом. Мы мутируем структурные элементы рибосомы, находящиеся между функциональными центрами, или внутри этих центров. Это делается с помощью методов генной инженерии: сайт-направленного и случайного мутагенеза, клонирования. Полученные мутанты анализируются нами биохимически как в составе живой бактериальной клетки, так и в пробирке.

    В живой клетке мы можем измерить точность биосинтеза белка, т.е. насколько часто рибосома совершает ошибки. Делается это с помощью специальных искусственно созданных генов, называемых репортерными. В них на генетическом уровне внесены дефекты - такие как несвоевременные сигналы остановки трансляции, замены важных кодонов и вставка или делеция нуклеотидов. Нормальный белок может получиться только при неправильном считывании таких дефективных мРНК. Только ошибка рибосомы, компенсирующая ошибку в мРНК, способна привести к функциональному репортерному белку. Эти ухищрения делаются специально для того, чтобы измерить частоту ошибок рибосомы и, конечно, определить, как на эту частоту влияют мутации. Увеличение частоты ошибок говорит о том, что центр связывания элонгационных факторов перестает "видеть" декодирующий центр.
    Гораздо больше мы можем понять из экспериментов с рибосомами в пробирке. Мы измеряем такие параметры, как связывание тРНК с А, Р, и Е участками, эффективность транслокации и гидролиза GTP.
    Кроме функциональных дефектов, мы можем понять, как мутации сказались на структуре рибосомы. Делается это двумя методами. Во-первых, с помощью "сшивок", когда в определенное место РНК (мРНК, тРНК или рибосомной РНК) вноситься т.н. фотоаффинный реагент: функциональную группу, которая при облучении УФ-светом образует ковалентную связь с молекулами, находящимися поблизости в пространстве. После такой "сшивки" можно определить, с чем тот или иной компонент рибосомы находится рядом. Имея набор данных о таком "соседстве" на разных этапах трансляции можно проследить перемещение функциональных центров или связующих их компонентов.


    Во-вторых, понять, как изменяется структура рибосомы в процессе трансляции и под действием мутаций можно с помощью химической модификации РНК. Есть набор реагентов, которые по-разному реагируют с нуклеотидами в зависимости от их конформации и пространственного окружения. Можно понять, какие нуклеотиды поменяли свое положение при том или ином процессе. Так, например, на рисунке справа под действием мутации изменили свое положение нуклеотиды, отмеченные красным цветом. Очевидно, что изменение структуры рибосомы свелось к смещению спирали H89, обозначенной синим. Эта спираль как раз лежит между пептидилтрансферазным центром и центром связывания элонгационных факторов.


    Для исследования мутаций, которые делают рибосому неактивной на каком-либо этапе ее функционирования, в нашей лаборатории разработана система аффинного выделения рибосом, превосходящая все существующие аналоги. Для такого выделения в рибосомную РНК встроен элемент, узнающий аффинный сорбент - стреправидин-сефарозу. При разрушении клеток, в которых синтезируются рибосомы, несущие такой элемент, получается смесь нормальных рибосом и рибосом с "ярлычком". С сорбентом связываются только рибосомы с "ярлычком" (аптамером). Затем, они могут быть элюированы и использованы для исследований. Разумеется, исследовать просто рибосомы с аптамером нет смысла, это просто метод, позволяющий выделять рибосомы, содержащие кроме "ярлычка" летальную мутацию, которую и надо исследовать.
    Работа нашей лаборатории развивается в нескольких направлениях. Кроме того, как передаются сигналы между функциональными центрами рибосомы, есть много загадок, которые еще предстоит разрешить. Так, мы начинаем исследовать не только бактериальные, но и эукариотические рибосомы. Также предстоит понять, как с рибосомой взаимодействует сигнал-узнающая частица - РНК-белковый комплекс, останавливающий трансляцию ряда белков, до тех пор, пока рибосома не присоединится к мембране.
    Мы всегда рады видеть трудолюбивых студентов у себя в лаборатории. Не стесняйтесь приходить к нам и вы многого сможете добиться !!!